同仁CCK8檢測步驟

1. 向各孔中加入100 μl細胞懸液。a)

2. 在37℃下預孵育培養板。b)

3. 向各孔中加入各濃度的待測溶液c)10 μl。

4. 37℃下孵育。

5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。

6. 37℃下孵育1-4小時。e)

7. 測定450 nm處的OD值。

 a) 使用適當的培養基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。

b) 建議使用CO2培養箱過夜預培養。

c) 使用培養基或PBS來制備溶液。

d) 如果待測溶液有還原性，測定不含細胞，但含有CCK-8的待測溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相對較大，則需要除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的100 μl培養基和10 μl CCK-8進行檢測。

e) 白細胞可能需要培養較長時間。

 活力計算

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

DOJINDO CCK8 初學者問答 (同仁DOJINDO)

1.一個孔中應接種多少個細胞？

當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

2.能否用384孔板進行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積20%的量。

3.能否用24孔板進行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液。

4.酚紅會影響檢測嗎？

不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性？

有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。

6.CCK-8能否檢測細菌細胞？

可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液，并培養1-4個小時或過夜。

7.CCK-8穩定嗎？

CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。

8.如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用450nm到490nm之間的濾光片。

9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？

可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

10.CCK-8是什么顏色？

應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

11.CCK8能否對活細胞進行染色？

不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。

12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？

CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養，如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

13.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

14.每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會有以下幾個原因： 1. 當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000個/孔范圍內摸索條件。

15.如何設定空白對照？

在不含細胞的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。

16.哪些物質會影響CCK8的測定？

當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

17.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

18.設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？

不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應該加多少量CCK-8試劑？…

一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10。

20.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？

有一下幾種方法（96孔板）： 1、在顯色反應后，將培養板放置4℃冰箱內。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內測定。

21.必須預培養細胞嗎？

不一定。如果要向保持細胞的最好狀態，建議預培養細胞。如果不做細胞預培養，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養，但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

22.如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。

23.CCK-8試劑的保存條件？

在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

24.預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數盤計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。

25.CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？

懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

27.應該每次做標準曲線嗎？

建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣，對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。

28.有時在藥物作用情況下，細胞已經死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？…

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數量，建議采用別的方法測定。

29.實驗之前，是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應？

建議使用一個孔作一下檢測，因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質，在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。